荧光单分子计数链霉亲和素标记藻红蛋白【烟台科瑞斯】下

3.单分子细胞表面成像

在培养的HEK293细胞上测试了进化保守且广泛表达的细胞表面蛋白β -连环蛋白(Beta-catenin)，用于单分子成像。β-连环蛋白是粘附结的结构成分，也是Wnt信号转导通路的效应因子。用结合AlexaFluor594的抗兔抗体进行免疫荧光成像，证实β -catenin在表面表达(图S5)。由于β-连环蛋白高度表达，我们滴定抗-连环蛋白一抗抗体浓度低于标准免疫荧光方案。可以清楚地看到HEK293细胞膜上明显的SA-PE病灶(图5A)。

选择单焦点并与高斯函数拟合，确定为单点源(图5B)。忽略一抗的对照实验仍然有可见和可量化的病灶，这表明细胞表面存在SA-PE的非特异性吸附。在10 ng mL−1的一抗和SA-PE存在的情况下，平均每100 μm2有3.8个病灶，单用SA-PE每100微米2有1.4个病灶（图 5c）。在不添加SA-PE的固定细胞上，每100μm 2仅能识别出0.1个病灶。当一抗浓度超过10 ng/ ml时， 可导致病灶荧光重叠和可分辨病灶减少。因此，我们检查带有0或10 ng /ml一抗的细胞的分布，并用高斯函数拟合扩展（图 5d）。在每 100μm有2～3个病灶2的区域内，两个种群有一定的重叠。因此，单个 细胞不能被准确地分配到任何一种情况，但群体水平的分析确实表明不同的分布。因此，SA-PE的单分子成像合于两个群体的半定量或二元分析。

三、结论

到目前为止，商用SA-PE已用于检测平均测量，如流式细胞术。本篇文章中表明SA-PE可以转化为数字检测的用途。为研究人员提供了一个更容易适应的单分子计数框架。基于生物素-链霉亲和素相互作用，提供了一个广泛的分析物检测“通用”平台。这种技术可以通过使用与检测抗体 （如抗FLAG）复合的其他藻胆蛋白来进一步复合。

参考文献：Epifluorescent single-molecule counting with Streptavidin-Phycoerythrin conjugates.

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